Ненад Тешовић: ПОРЕКЛО ЖИВОТА (2) – СА ТЕОРИЈЕ НА ПРАКСУ

Погледајмо сада у пракси домете науке у решавању овог изазовног проблема.

Са теорије на праксу

Један од најугледнијих органских хемичара Алберт Ешенмозер, покушао је да направи пентозу, шећер са пет атома угљеника, на начин на који се то могло десити на пребиотичкој Земљи.[8] Ради се дакле о покушају решавања првог корака – синтези моносахарида рибозе.

Директна синтеза пентозе није успела када је почео од подразумеваног једноставног прекурсора гликолалдехида користећи формозну реакцију. Дошао је на сјајну идеју да не почне ни од формалдехида, ни од гликолалдехида, већ од гликолалдехид фосфата чиме је унапред обезбедио неопходни фосфат. Решио је низ крајње сложених проблема везаних за правовремено прекидање хемијске реакције и осмислио најбољи начин за пречишћавање добијеног једињења који су тешко замисливи ван лабораторије, и поред свега крајњи резултат није била жељена пентоза већ углавном рацемска смеша других једињења.

Била је потребна још једна оригинална идеја, стављање гликолалдехид фосфата у јаку базу и додавање мале количине формалдехида, да би добио 40-50% смеше већином рацемске пентозе дифосфата. Ово је био феноменалан резултат који се често узима за пример успешне синтезе пентозе у пребиотским условима.

Постоји само један проблем, а то је велика количина различитих једињења у резултујућој смеши која је чине неупотребљивом. Поред тога што је смеша рацемска, што садржи свих осам изомера пентозе, она садржи и 11 других угљених хидрата укључујући и њихових 11 енантиомера, а то је само мањи део смеше јер 50-60% чине неидентификовани олигомери и полимери.

Ешенмозер није ни покушавао да издвоји тражени енантиомер пентозе из раствора јер би то било практично немогуће, већ је за даље кораке једноставно купио рибозу изоловану из живих система.

Многи у овом покушају желе да нађу оправдање за своју веру у абиогенезу, али овај исход пре указује на то да ово није могао бити начин стварања градивних блокова угљених хидрата, јер чак и у савременој лабораторији уз сво искуство укључених научника и уз пажљиву контролу свих услова, добијена је неупотребљива смеша свакојаких једињења.

Да сумирамо. За синтезу полисахарида неопходни су моносахариди, а нико никада није успео да створи ниједан. Да бисмо погледали детаљније колико је тешко полимеризовати шећере, замислићемо да на располагању неким чудом имамо неопходне моносахариде, рецимо узете готове из живих организама, што је једини начин познат људима да се до њих дође.

Можда ово више и није тако неочекивано, али такође нико никада није успео да полимеризује полисахариде неопходне за изградњу нуклеотида.

Основни проблем овог процеса је тежак, али га је лако објаснити. Моносахариди имају више крајева којима се могу међусобно повезати гликозидном везом. Једним крајем се повезују са претходним, а неким другим крајем са наредим шећером у низу.

Погодићете, постоји стриктно правило који се крај увек користи за повезивање са претходним, а који са наредним, а атоми нас не питају шта да раде.

Од претходног сумирања ситуација је постала још безнадежнија. Не умемо да направимо шећере. Још мање знамо како бисмо могли направити хомокиралне шећере. Чак и да то можемо, не знамо како бисмо их прочистили и извукли из раствора, а и да то успемо, не умемо их међусобно повезати.

Колико избор правих крајева за повезивање може бити проблем? Иако то не можемо контролисати, можда ће се из више пута добити тражена комбинација?

Ако бисмо узели 6 једнаких молекула Д-глукозе, они би се могли међусобно повезати на више од трилион начина (број са 12 нула).[9]

Шанса је очигледно мала да добијемо жељени полисахарид, и то када посматрамо низ од само 6 једнаких шећера. Амилоза са претходне слике најчешће има више хиљада молекула Д-глукозе, све повезане идентично тако што је угљеник-1 претходног молекула повезан са угљеником-4 следећег (1→4). Вероватноћа да тако нешто настане случајним процесима је толико мала да не би било довољно, не милијарду година, него број година који би се изговорио ако бисмо понављали “милијарду, милијарду, милијарду, … милијарди” неколико минута непрекидно.
Али у лабораторијама се синтетишу полисахариди?

Најсавременије методе синтетичке хемије омогућавају прављење полисахарида састављених од малог броја шећера.[10] Објашњење свих корака неопходних за постизање тог достигнућа простире се преко стотина и стотина страница научних радова и представља један од најтежих задатака у целој синтетичкој хемији, и све то наравно након што се Д-глукоза купи готова. Да се и она мора генерисати проблем би био још већи јер нико никада није успео да је генерише. Само живе ћелије имају технологију која их ствара.

Тако и поред узимања готове глукозе из природе, у најсавременијим лабораторијама могу се створити само најједноставнији полисахариди, а и тај процес је сложен и представља један од најсложенијих процеса у синтетичкој хемији.

Протеини

Протеини се добијају полимеризацијом (повезивањем) аминокиселина. Хемијска реакција спајања две аминокиселине је кондензациона реакција, названа тако јер се том приликом ослобађа молекул воде. Већ се пали знак питања, и то не један већ два. Треба објаснити настанак живота у води, а пептиди[11] се у њој не спајају већ распадају (хидролиза). Поред тога хемијска реакција која ствара воду, у води, не звучи као кретање низбрдо, већ узбрдо, веома узбрдо. Јако је тешко замислити да се овакве реакције спонтано дешавају у некаквом преисторијском океану, што већ на самом почетку представља огроман проблем за све оне који желе да верују у спонтану абиогенезу.

Протеини живих система су хомокирални што значи да су све аминокиселине у низу правилно оријентисане. Ово је други нерешив проблем јер се у природи не стварају хомокиралне структуре. Најбољи покушај објашњења могућности стварања хомокиралних пептида је њихова катализа на минералним површинама које имају својство киралности. Овај сценарио је само лепа жеља оних који желе да верују у абиогенезу. Не постоји научни рад који објашњава такав процес. Напротив, студије које су се бавиле том темом показале су да тако нешто није могуће.

Метју Паунер, један од највећих светских стручњака из области органске хемије, објавио је у јулу 2019. године студију[12] у часопису Nature који се бави синтезом протеина у води. Већ у првом пасусу се каже:

Пептиди су суштински елемент свог живота на Земљи. Толико су много уплетени у физиологију да је тешко замислити живот без њих. Биосинтеза пептида се сада спроводи комплексним системом генетски кодираних ензима, али је незамисливо да су се ови софистицирани и координисани макромолекули изненада појавили током стварања првог живота.

Спонтано генерисање пептида је незамисливо. Ако неко жели да верује у тако нешто може, али то не треба мешати са науком.

У наставку истог рада дато је и објашњење зашто је поменута полимеризација пептида у води тешко изводљива:

Опште је прихваћено да су пептиди производ полимеризације аминокиселина. Иако концептуално једноставне, у пракси постоје добри разлози зашто су ове реакције неефикасне у води. На пример, аминокиселине (pKaH = 9,4) су цвитерјонске при физиолошкој киселости, што гаси њихову нуклеофилност протонацијом, а агенси за електрофилну кондензацију који активирају мономере аминокиселина могу неповратно блокирати синтезу пептида као и дериватизовати остатке бочног ланца аминокиселина.

Паунер у наставку излаже сопствену идеју како би се могао решити један део проблема, али ни не покушава да се осврне према проблему хомокиралности.

Оно што је занимљиво напоменути за ову студију је да она практично чини небитним Милер-Јуријев експеримент. Њиме је показано да је могуће створити (рацемску) смешу аминокиселина, али сазнајемо да је њихова полимеризација незамислива.

Што се тиче самих аминокиселина, од њих 20 колико их постоји у природи, све осим једне (глицина) имају асиметрични атом угљеника и киралне су. Нико никада није направио хомокиралне аминокиселине што је нерешив проблем који претходи нерешивом проблему њиховог повезивања.

Савремене машине за полимеризацију пептида користе готове хомокиралне аминокиселине узете из природе. Оне се добијају узимајући пептиде из живих система из којих се издвајају хидролизом. Чак ни то није довољно за поновну полимеризацију јер аминокиселине имају више крајева који могу учествовати у повезивању па је потребно заштитити поједине делове посебним заштитним групама, и тек се тако припремљен молекул продаје ради употребе у машинама за полимеризацију. Сценарио препун строге контроле на сваком кораку, незамислив у природи, а нарочито у океану.
На крају, чак ни најсавременије машине не могу синтетисати дугачке пептиде. Уобичајени ланци су дужине до 50 аминокиселина а низови од 75 до 100 су јако тешки за генерисање. Живе ћелије стварају неупоредиво веће протеине са незамисливо већом прецизношћу. Најбоље комерцијалне машине гарантују тачност од 99,8% при сваком кораку. Повезивање сваке аминокиселине подразумева четири корака: деблокирање, повезивање, уклањање заштитне групе и оксидација, тако да се за низ од само 100 аминокиселина добија принос од 0,998400 = 45% траженог пептида. Остатак материјала имаће различите делове који недостају и често их је тешко одвојити од тражених. Тај процес је углавном још сложенији и траје дуже од саме синтезе. За то се најчешће користе комерцијални уређаји за течну хроматографију високих перформанси (HPLC).

У каквом окружењу је настао живот

Постоји више различитих мишљења о томе у каквом је окружењу могао настати живот. То је логично јер је за неке кораке потребно једно окружење, а за неке је потребно друго, па није лако одлучити се.

Како и где је настао живот на Земљи? До данас су различита окружења предложена као вероватна места за настанак живота. Остаје нејасно које геохемијске ситуације могу покретати све фазе хемијске еволуције, у распону од кондензације једноставних неорганских једињења до појаве самоодрживих система који су се могли развити у модерне биолошке.

Један од научних радова[13] набраја осам различитих окружења за неопходне хемијске реакције, чиме се практично оповргава широко прихваћена претпоставка о океану, или плићаку. У ствари елиминише се свако окружење јер се захтева систем од више потпуно различитих окружења између којих се молекули преносе за сада непознатим научно-фантастичним сценаријом. Разлог више за помињање научне фантастике је и то што овај научни рад за нерешена питања наводи ванземаљско порекло потребних градивних блокова.

Неопходност ових међусобно искључивих услова јасно указује на то да настанак живота није настао у једном окружењу; него је захтевао веома разнолика и динамична окружења која су била повезана једно са другим да би омогућила унутрашњи транспорт реакционих производа и реактаната кроз циркулацију течности.

Наука нема одговор на то како би се полимери могли спонтано генерисати, нити у каквом би то окружењу било могуће. Тражење излаза позивањем на ванземаљско порекло само потврђује неоснованост општеприхваћеног веровања да су случајни процеси током дугог временског периода створили живот од неживе материје.

Нуклеинске киселине

Нуклеинске киселине сачињене су од низа нуклеотида. Нуклеотид се састоји од три дела: азотне базе, пентозног шећера и фосфатне групе. Нешто једноставније једињење без фосфатне групе, које има само пентозни шећер и азотну базу називамо нуклеозид. Уколико се на месту пентозног шећера налази рибоза, тада га називамо рибонуклеозид. Рибонуклеозид без хидроксилне групе на 2’ угљенику рибозе назива се дезоксирибонуклеозид.

Исто правило односи се и на нуклеотид. Уколико на 2’ угљенику рибозе нема хидроксилне групе, онда се ради о дезоксирибонуклеотиду, главном градивном блоку ДНК. Са друге стране, РНК се гради од рибонуклеотида које имају ову хидроксилну групу.

Рибоза је угљени хидрат и као што је објашњено раније, практично ју је немогуће генерисати јер има четири стереогена центра (1’, 2’, 3’, 4’) па самим тим има 24 = 16 могућих изомера. Због тога се рибоза увек купује готова, узета из природе, за потребе синтезе нуклеинских киселина у савременим лабораторијама.
У живим системима на месту базе, везане за 1’ угљеник, налазе се пиримидини цитозин (C), урацил (U) и тимин (T), и пурини аденин (A) и гуанин (G).

Синтеза РНК и ДНК је немогућа због два основна проблема, непостојања контроле киралности и великог броја стереогених центара који произвољно учествују у повезивању молекула. Научни радови које се баве овом темом, као што су “Origins of building blocks of life: A review”[14] и Садерлендов “Common origins of RNA”[15] покушавају најдетаљније могуће да објасне безбројне кораке овог сложеног процеса, при чему се они врше у максимално контролисаним условима, техникама које су незамисливе за пребиотску Земљу (фино подешавање различитих температура за сваку реакцију понаособ, правовремено испирање леденом водом и сушење у вакууму, редовне pH корекције, итд.) Поред свега, добијена једињења су препуна нечистоћа и потпуно су неупотребљива. Сваки наредни корак започет је одбацивањем свега до тада урађеног, и куповином потребних једињења. На крају, кључни делови везани за контролу киралности уопште нису поменути већ су елегантно прескочени. Добијене рацемске смеше никада не би довеле до успешне полимеризације.

Саморепликација РНК

Последњих година све је популарнија теорија “РНК света” која тврди да је на почетку највероватније спонтано настао РНК молекул који је наставио да се самореплицира, мењајући се и усложњавајући се док се нису добиле све структуре неопходне за живот.

Може ли се РНК самореплицирати?

Генерално, за репликацију РНК неопходан је ензим који се зове РНК полимераза или РНК репликаза. Научници инспирисани идејом “РНК света” направили су посебно осмишљен молекул РНК који се може самореплицирати без додатног ензима.[16] Чак и најбољи од ових самореплицирајућих РНК молекула су неупотребљиви у пракси јер њихове копије не садрже довољно оригиналног молекула како би се обезбедила даља репликација. Конкретно, РНК ланац од 189 база реплицирао се у полимер од 11 база. Дакле молекул који је осмишљен и направљен искључиво за сврху саморепликације, ископирао је 6% свог садржаја. Најбољи постигнути резултати били су полимери од 14 нуклеотида[17] и 20 нуклеотида[18], и били су бескорисни за даљу репликацију.

Савремена наука је истражила могућност саморепликације РНК и одговор је да уз сво знање и намеру да се такав молекул направи, већ први циклус представља неуспех, а други циклус не постоји ни у теорији. Није на одмет напоменути да су сви неопходни нуклеотиди за стварање жељеног РНК ланца купљени готови, издвојени из природе.
Једна од најновијих студија[19] наводи:

Став да би деоксинуклеозиди били доступни поред рибонуклеозида, иако стар, није толико популаран као хипотеза РНК света. Међутим, мора се истаћи да је РНК-центричан поглед ограничен у својој валидности и да је – с правом – критички доведен у питање.

Изгледа да прича око РНК света и саморепликације РНК није постала позната јер је потврђена научним чињеницама, већ зато што има потенцијал да највећи број људи поверују у њу. Овде се изгледа из домена науке прешло у домен пропаганде.

Време и деградација молекула

Још једна популарна заблуда је веровање да би довољно дугачак временски период могао довести до спонтаног генерисања замишљеног молекула РНК. То би било јако лепо да време не разграђује све биомолекуле, а не обратно.

Ово је најлакше проверити на сајту неке од фирми које продају нуклеотиде. На страници компаније Merck[20] наводи се да су “ДНК олигонуклеотиди релативно стабилни” и да “захтевају одређене методе руковања и складиштења” како би се обезбедило што дуже трајање производа. Наводи се да ДНК ланац ускладиштен у замрзивачу на -20°C стабилан око 2 године, у фрижидеру на 4°C око годину дана, на собној температури 3 до 6 месеци, а у летњим транспортним условима без климатизације један до два месеца.

Процесима пребиотичке синтезе живота дају се милијарде година које треба да произведу жељени молекул, а видимо да у трептају ока у поређењу са тим временом долази до разградње ДНК. За разлику од ДНК, РНК молекул има хидроксилну групу што га чини много НЕСТАБИЛНИЈИМ.

RNK је подложна аутокатализи (саморазградњи).[21]

РНК нуклеотиди се складиште на -80°C у специјалним растворима јер присуство 2’ хидроксилне групе доводи до аутокаталитичког распадања РНК.[22] Тешко је замислити да је било какав РНК ланац могао бити створен испод некаквог камена у плићаку пребиотске Земље.

Џон Садерленд објавио је рад за часопис Nature Chemistry у коме показује сједињавање градивних блокова у нуклеинску киселину.[23] Поред тога што је купио готове нуклеотиде и готове хомокиралне аминокиселине, већ током првог корака, током реакције њиховог повезивања, аминокиселине су постале рацемске, изгубиле су своју хомокиралност. Занемаримо овај мали проблем и погледајмо добијени резултат. У фино подешеној киселости окружења, најбољи резултат био је принос од 4,7% жељеног једињења које је постигнуто након 12 сати, али је након 48 сати тај проценат пао на 2%. То значи да се више од половине добијеног РНК разградило већ након два дана. Исти услови коју су потребни за синтезу РНК, истовремено доводе до њене разградње.

Време није решење. Време је проблем.

Липиди

Липиди су једињења која се примарно дефинишу својом функцијом а не структуром. Типичан липид има хидрофилну поларну групу (главу) која је растворљива у води, повезану на хидрофобни реп од угљоводоника који је нерастворљив у води. Многи изједначавају липиде са мастима, али масне киселине су само једна од врста липида.

Липиди су важни јер је од њих направљена мембрана сваке живе ћелије. Најчешће се ради о фосфолипидима (липидима који садрже фосфатну групу) чија је основа глицерол.

Сам глицерол је акиралан али има енантиотопску хидроксиметилну групу (−CH2−OH). Повезивањем две масне киселине, угљеник глицерола постаје стереогени центар добијеног киралног молекула.

Преостала хидроксиметилна група најчешће је повезана на фосфатну групу на коју је даље повезан молекул етаноламина, и тако се добија типичан фосфолипид од кога су направљене ћелијске мембране. Ради што једноставнијег објашњења узет је за пример једноставан фосфолипид са једним стереогеним центром. Постоје липиди са 4 могућа стереоизомера од којих се само један користи у живим системима.

Због изражене хидрофобности репа и хидрофилности главе, фосфолипиди се у присуству воде сви оријентишу у истом правцу. Пошто се у случају живих ћелија вода налази са обе стране мембране (она је и унутар и ван ћелије) формира се фосфолипидни двослој.

Неко би могао помислити да је прављење мембране ћелије јако једноставно, да се она практично сама генерише. То је управо став промотера спонтане абиогенезе, али они избегавају да помену да нико никада није успео да синтетише липид, а такође не помињу ни неколико важних детаља који се тичу липидних двослојева:

1. Фосфолипидни двослој не пропушта јоне. Неке електронеутралне честице могу проћи кроз њега, као на пример кисеоник. Супстрати који су растворљиви у угљоводоницима не пролазе кроз мембране ћелија, док супстрати који су веома растворљиви у угљоводоницима остају заробљени унутар фосфолипидног двослоја. Због тога се лекови морају направити прецизно, тако да њихова растворљивост омогућава њихов пролаз кроз фосфолипидни двослој до унутрашњости ћелије.

2. Бактерије, за које се често мисли да су пример једноставније ћелије, често имају јако сложене ћелијске мембране.

3. Ћелијска мембрана је препуна различитих протеина који имају посебне функције, најчешће везане за контролу протока јона и молекула у и из ћелије. Никада није показано да хомогени липидни двослој може функционисати као ћелијска мембрана.

4. Липидни двослоји се не налазе само на ободу ћелије, већ окружују и неке ћелијске органеле као што су једро и митохондрије у еукариотским ћелијама, који сами за себе чине сложене микросистеме. Сваки од њих има свој сопствени састав липида, различит од мембране ћелије.

5. Липидни двослоји нису симетрични. Њихов унутрашњи и спољашњи слој липида се разликује и никада није показано да симетрична конструкција може служити као мембрана ћелије.

6. Липидни двослоји имају огроман број поликарбохидратних израслина, глукана, кључних за регулацију ћелијских процеса.[24]

Погрешни стереоизомери липида нису способни да учествују у ћелијским процесима.[25] Ово је, наравно, проблем. Као што је поменуто код других градивних блокова, атоми не питају никога како ће се оријентисати током хемијске реакције. Не постоји начин за добијање хомокиралних молекула глицерола. Нико то никада није успео да уради. Наука нема одговор на питање како их синтетисати у лабораторији, а камо ли како су могли настати у плићаку на пребиотској Земљи.

[1]Albert Eschenmoser, „Etiology of Potentially Primordial Biomolecular Structures: From Vitamin B12 to the Nucleic Acids and an Inquiry into the Chemistry of Life’s Origin: A Retrospective“, Angewandte Chemie International Edition Volume 50, Issue 52, December 23, 2011

[9]Roger A. Laine, Invited Commentary: A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 × 1012 structures for a reducing hexasaccharide: the Isomer Barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems, Glycobiology, Volume 4, Issue 6, December 1994, Pages 759–767, https://doi.org/10.1093/glycob/4.6.759

[10] Sicheng Lin and Todd L. Lowary, „Synthesis of a Highly Branched Nonasaccharide Chlorella Virus N-Glycan Using a „Counterclockwise“ Assembly Approach“, September 17th, 2020

[11] Ланци до 50 аминокиселина најчешће се називају пептидима, док се протеинима називају дужи низови.

[12]Canavelli, P., Islam, S. & Powner, M.W. Peptide ligation by chemoselective aminonitrile coupling in water. Nature 571, 546–549 (2019)

[13]Norio Kitadai, Shigenori Maruyama, Origins of building blocks of life: A review, Geoscience Frontiers, Volume 9, Issue 4, 2018, Pages 1117-1153

[14]Norio Kitadai, Shigenori Maruyama, Origins of building blocks of life: A review, Geoscience Frontiers, Volume 9, Issue 4, 2018, Pages 1117-1153

[15]Patel, B., Percivalle, C., Ritson, D. et al. Common origins of RNA, protein and lipid precursors in a cyanosulfidic protometabolism. Nature Chem 7, 301–307 (2015)

[16]Tracey A. Lincoln and Gerald F. Joyce, Self-Sustained Replication of an RNA Enzyme, Science. 2009 Feb 27; 323(5918): 1229–1232.

[17]Johnston W.K., Unrau P.J., Lawrence M.S., Glasner M.E., Bartel D.P.. RNA-catalyzed RNA polymerization: accurate and general RNA-templated primer extension. Science. 2001; 292:1319–1325.

[18]Hani S. Zaher and Peter J. Unrau, Selection of an improved RNA polymerase ribozyme with superior extension and fidelity, 2007

[19]Krishnamurthy, Ramanarayanan & Jiménez, Eddy & Gibard, Clémentine. (2020). Prebiotic Phosphorylation and Concomitant Oligomerization of Deoxynucleosides to form DNA. Angewandte Chemie International Edition. 60.10.1002/anie.202015910.

[20] https://www.sigmaaldrich.com/RS/en/technical-documents/protocol/genomics/dna-and-rna-purification/oligonucleotide-handling-and-stability

[21] https://www.sigmaaldrich.com/RS/en/technical-documents/protocol/genomics/dna-and-rna-purification/oligonucleotide-handling-and-stability

[22] https://www.sigmaaldrich.com/RS/en/technical-documents/protocol/genomics/dna-and-rna-purification/oligonucleotide-handling-and-stability

[23] Liu, Z., Wu, LF., Xu, J. et al. Harnessing chemical energy for the activation and joining of prebiotic building blocks. Nat. Chem. 12, 1023–1028 (2020).

[24]Ajit Varki, Biological roles of glycans, Glycobiology, Volume 27, Issue 1, 1 January 2017, Pages 3–49

[25]Molecular and Cell Biology of Lipids, Biochimica et Biophysica Acta, 1530, 219-226, (2001).